Tháng 8 năm 1975, bà vào làm nhân viên Văn phòng Ban Kinh tài Khu 8.

Sau khi Việt Nam thống nhất, bà được chuyển sang làm tại Văn phòng Ty Tài chính Bến Tre (sau là Sở Tài chính Bến Tre), bắt đầu sự nghiệp hoạt động trong ngành tài chính.

Bà thăng dần từ các bậc Chuyên viên, Phó phòng, Trưởng phòng, Phó giám đốc, quyền Giám đốc và chính thức được bổ nhiệm làm Giám đốc Sở Tài chính Bến Tre vào tháng 10 năm 1991. Đến tháng 4 năm 1995, bà được điều về Trung ương và được bổ nhiệm làm Thứ trưởng Bộ Tài chính.

Tháng 2 năm 2006, bà được điều chuyển trở lại làm Thứ trưởng Bộ Tài chính, tuy nhiên chỉ 1 tháng sau lại được điều sang làm Thứ trưởng Thường trực Bộ Thương mại.

Tháng 5 năm 2007, bà được bầu làm Đại biểu Quốc hội khóa XII.[5] Tháng 8 năm 2007, bà được đề cử và được phê chuẩn vào chức vụ Bộ trưởng Bộ Lao động - Thương binh và Xã hội và giữ chức vụ này cho đến tháng 7 năm 2011.[6] Một trong những sự kiện bà Kim Ngân để lại dấu ấn khi làm tại Bộ Lao động - Thương binh và Xã hội là cuộc giải cứu các lao động Việt Nam tại Lybia vào năm 2011.[7]

Tháng 5 năm 2011, bà tái đắc cử vị trí Đại biểu Quốc hội khóa XIII. Ngày 23 tháng 7 năm 2011, bà được Chủ tịch Quốc hội đề cử làm Phó Chủ tịch Quốc hội.

Ngày 31 tháng 3 năm 2016, tại Kỳ họp thứ 11, Quốc hội khóa XIII, bà được bầu làm Chủ tịch Quốc hội nước Cộng hòa Xã hội Chủ nghĩa Việt Nam và Chủ tịch Hội đồng bầu cử Quốc gia Việt Nam, bà trở thành nữ chính khách Việt Nam đầu tiên giữ các cương vị này, đồng thời cũng là người đầu tiên thực hiện quy định tuyên thệ khi nhậm chức[8] theo quy định của Hiến pháp 2013.

Đại biểu Quốc hội Việt Nam thành phố Cần Thơ (2016-2021)

Ngày 22 tháng 5 năm 2016, bà Nguyễn Thị Kim Ngân trúng cử đại biểu Quốc hội Việt Nam khóa 14 nhiệm kì 2016-2021 tại đơn vị bầu cử số 1 thành phố Cần Thơ gồm quận Ninh Kiều, quận Cái Răng và huyện Phong Điền với tỉ lệ 91,46% phiếu thuận cao nhất thành phố này.[9][10]

Ngày 4 tháng 5 năm 2018, bà có buổi tiếp xúc cử tri tại xã Mỹ Khánh (huyện Phong Điền) và phường An Bình (quận Ninh Kiều) để lấy ý kiến cử tri trước kỳ họp thứ 5, Quốc hội khóa 14.[11]

Chủ tịch Quốc hội nhiệm kì 2016-2021

Sáng ngày 22 tháng 7 năm 2016, bà Nguyễn Thị Kim Ngân được các đại biểu Quốc hội Việt Nam khóa 14 bầu làm Chủ tịch Quốc hội Việt Nam khóa 14 với tỉ lệ 483/489 phiếu thuận (tổng 490 phiếu, 1 phiếu không hợp lệ).[12]

Trong nhiệm kì của bà, Quốc hội Việt Nam có điểm mới về hình thức hoạt động là chuyển từ tham luận sang tranh luận.[11]

Bà có một trợ lý là Lê Minh Thông, phó giáo sư, tiến sĩ luật, cựu đại biểu Quốc hội Việt Nam khoá 13.[13][14][15]